故事发生在日本江户时代，武士桂小太郎（石田彰 配音）面前出现了一位神秘男子，他手握妖刀“红樱花”，要求试刀。那晚之后，桂的下落不明。桂的宠物伊丽莎白（高松真司 配音）找到了师父家的神乐（钉宫理惠 配音）和新八（坂口大辅 配音），委托他们寻找主人的下落。与此同时，银时（杉田智和 配音）也被委托寻找处处作恶的红樱花的下落。三人的线索汇聚在一艘飞艇上。由于远离警方管辖范围，飞艇内的邪恶势力一手遮天蔽日。在那里，银时遇见了昔日战友、如今的对手高杉晋介（配音：子安武人）。高杉正率领着自己的鬼怪军团，企图毁灭江户。一边是凶残的恐怖分子，另一边是残忍嗜血的魔剑红樱，身负重伤的银时能否安全逃脱，拯救江户呢？
本次剧场版重制了《银魂》动画中的“红樱篇”，其中，原作中未曾登场的新选组也将在故事中大显身手。
